CRISPR/Cas9-Technologie zur in-vitro-Charakterisierung von Rezeptoren und Proteinen mit unbekannter physiologischer Funktion
Mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie können Zelllinien, die endogen Rezeptoren oder andere interessierende Proteine exprimieren, gezielt verändert und anschließend untersucht werden. So ist es nicht nur möglich, gezielt bestimmte Proteine zu inaktivieren (knockout) oder Mutationen einzufügen und deren Einfluss auf den Zellstoffwechsel zu untersuchen. Ebenso können Gene gezielt modifiziert werden um sie besser untersuchen zu können. Somit kann die Genregulation, die zelluläre Lokalisation oder es können Interaktionen zwischen Proteinen untersucht werden.
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Charakterisierung ausgewählter purinerger Rezeptoren und ihrer zellulären Funktion
GPCR der P2Y-Familie (z.B. P2RY14, GPR34) werden mit Hilfe von Tiermodellen und Zelllinien untersucht, um die Funktion dieser Rezeptoren im Organismus und in speziellen Zellpopulationen besser zu verstehen. Mit Hilfe von RNAscope ISH- Hybridisierung (in Zusammenarbeit mit den Kollegen der Anatomie) können z.B. spezifische mRNA-Moleküle auf zellulärer Ebene sichtbar gemacht werden. Je nach Expressionsmuster wird das entsprechende Organ bzw. die Zellpopulation genauer untersucht. Mit Hilfe von Zelllinien und der CRISPR/Cas9-Methodik können Mutationen bzw. Rezeptorveränderungen in Zellen nachgestellt und genauer untersucht werden. Dafür ist die beständige Etablierung neuer Methoden und die Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen ein essentieller Bestandteil der Forschung.
Für das Verständnis und die Einordnung der Rezeptorfunktion in zelluläre Netzwerke kommen auch Methoden wie die mRNA-Sequenzierung zum Einsatz um Veränderungen in zellulären Signalwegen bei Verlust der Rezeptoren zu identifizieren.
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Proteine mit unbekannter physiologischer Funktion
Fibin – ein sekretorisches Protein
Defekte in GPCR sind häufig die Ursache von Erkrankungen. So führt der Funktionsverlust des Vasopressin Typ2-Rezeptors in der Niere zum Erkrankungsbild des Nephrogenen Diabetes insipidus (NDI). Bei der Untersuchung, welche Veränderungen beim Funktionsverlust dieses Rezeptors in der Niere auftreten, fiel uns ein unbekanntes Protein auf, das den Namen „Fibin" trägt.
In diesem Projekt versuchen wir die Rolle von Fibin im Organismus herauszufinden.
Sowohl in Zelllinien, als auch im Tiermodell untersuchen wir, welche physiologische Funktion Fibin hat. So konnten wir zeigen, dass es von Zellen sekretiert wird. Es kommt vor allem in Fibroblasten in verschiedenen Geweben des Körpers vor und könnte eine Rolle z.B. bei der Wundheilung und der Herzfunktion spielen. Durch die Zusammenarbeit mit Arbeitsgruppen der Dermatologie, des Herzzentrums und der Anatomie wollen wir dem Geheimnis dieses Proteins auf die Spur kommen.
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Quantifizierung von Fibin-mRNA in Fibroblasten aus normaler Haut und Fibroblasten aus einer 10 Tage-alten Wunde. Während der Wundheilung wird verstärkt Fibin gebildet (links). RNAScope in situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie einer Herzklappe (rechts). Fibin-mRNA - rot, Zellkerne – blau, Vimentin -grün
