Methodenverzeichnis

Die konventionelle oder Endpunkt-PCR amplifiziert die gewünschte Zielsequenz billionenfach in einem logarithmischen Anstieg. Möglich ist dies durch die Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase und spezifischen Oligonukleotiden (sog. Primern), die an bekannten Ziel​sequenzen binden und damit den Start- und Endpunkt des zu amplifizierenden Genbereiches markieren. Diese Methode wird beispielsweise beim Nachweis von Erregern verwendet.​

Die quantitative PCR wird für die gleichzeitige Vervielfältigung und Detektion von PCR-Produkten eingesetzt. Der Vorteil hierbei ist, dass die PCR-Produkte während der Messung genau quantifiziert werden können. Möglich ist dies durch Fluoreszenz-markierte Sonden, die während der PCR an dem Amplifikaten binden und Lichtsignale abgeben, welche gemessen werden können. Durch den Vergleich mit Eichproben kann so der prozentuale Anteil an Tumorzellen bestimmt werden.​

Die Fragment-Längenbestimmung von PCR-Produkten kann mittels Kapillargelelektrophorese durchgeführt werden. Hierbei nutzt man  die negative Ladung von den DNA-Fragmenten aus, da diese in einem quervernetzten Agarosegel zur positiv geladenen Anode wandern. Auf diese Weise können die PCR-Produkte visualisiert und mit bekannten Fragmentlängenmustern bestimmter Erkrankungen wie T-und B-Zell-Neoplasien  oder Mikrosatelliteninstabilitäten verglichen werden.

Die nach ihrem Entwickler benannte Sanger-Sequenzierung nutzt für die Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten neben Nukleotiden auch Fluoreszenz-markierte Didesoxynukleotide. Der Einbau dieser markierten Nukleotide führt zum Abbruch der Reaktion, sodass Fragmente unterschiedlicher Längen entstehen. Da jedes der vier Didesoxynukleotide einen spezifischen Fluoreszenzfarbstoff tragen, lässt sich durch Analyse in einem Polyamidgel die genaue Reihenfolge der Sequenz ablesen.

Die genaue Darstellung der genetischen Veränderungen ist bei dieser Methode möglich, allerdings wird wegen der geringen Sensitivität ein minimaler Tumorzellgehalt von 20% benötigt.​

Für die Untersuchung der Mutationslast in Tumorproben kann die Pyrosequenzierung als Untersuchungsmethode dienen. Während der DNA-Synthese werden nacheinander die vier Fluoreszenz-markierten Nukleotide zum Einbau durch die DNA-Polymerase angeboten und wieder ausgewaschen. Bei erfolgreichem Einbau eines der Nukleotide wird ein Lichtsignal abgegeben und über die Stärke dieses Signals lässt sich eine Aussage über die eingebaute Anzahl des jeweiligen Nukleotids schließen. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass sich unbekannte oder sehr komplexe Mutationen nicht ermitteln lassen.​

Durch die Etablierung der Next Generation Sequenzierung steht nun ein Hochdurchsatzverfahren zur Verfügung, das es ermöglicht gezielte Stufendiagnostik und multiple Genuntersuchungen durchführen zu können.

Für die Analyse wird das Genmaterial aus FFPE-Proben nach der DNA-Isolierung enzymatisch fragmentiert, gezielte Sequenzbereiche PCR-basiert amplifiziert und anschließend durch DNA-Adaptoren an eine Flusszelle gebunden. Die parallele Sequenzierung tausender Genfragmente erfolgt durch den Einbau von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden. Da jedes der vier Nukleotide ein spezifisches Fluoreszenzmolekül trägt, lässt sich anhand der Abfolge der Signale während der Gensynthese die Sequenz bestimmen. Die eingebauten Nukleotide tragen eine Terminatorgruppe, welche nach Auslesen des Signals abgespalten wird, sodass das nächste Nukleotid eingebaut werden kann.

Die Auswertung der Sequenzierdaten erfordert einen hohen Durchsatz von bioinformatischen Berechnungen und erzielt optimalerweise eine Überlappung der Sequenzen. Durch den Abgleich mit externen Datenbanken können nun die zugrunde liegenden Mutationen sowie die Höhe der Mutationslast aus den Daten abgelesen werden.​

Der Array verfügt neben Positivkontrollen auch über die Möglichkeit die Erreger zu typisieren. So können 41 HPV-Typen bzw. 16 Mycobakterien-Spezies unterschieden werden.​

Die direkt am histologischen Schnittpräparat durchgeführte In situ Hybrisierung kommt ohne Genamplifizierung aus. Für die Untersuchung werden mit Permanentfarbstoff-markierte DNA-Sonden verwendet, um die gewünschten Genbereiche optisch sichtbar zu machen. Eine Diskriminierung von Gen-Translokationen und Genamplifizierungen werden dadurch möglich.​